多聚甲醛固定液(实验笔记丨免疫荧光细胞样品制

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

直接法

将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。

间接法

如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗体—抗原—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。

基本实验步骤及注意事项：

1、吸弃培养基，用PBS洗涤细胞2次，每次1 min，期间，轻轻晃动小皿3-5次；

注意: 小孔中培养基不用特意吸弃干净，以免处理过程中损失太多的细胞。

2、弃尽小皿和小孔中的PBS后，加入1 ml 4%的多聚甲醛固定液(由pH 7.4的PBS配制)固定细胞10 min，弃多聚甲醛固定液，用PBS洗涤细胞两次，每次1 min；

注意: 4%多聚甲醛有效期为2-3个月，注意及时更换溶液，以免影响固定的效果。

3、弃尽小皿和小孔中的PBS后，加入由PBS配制的0.2%的Trion X-100通透8-15 min (由细胞的疏密决定)，PBS洗涤细胞两次，每次1 min；

注意: 通透时间不能超过15 min。

4、使用由PBS配制的3%的BSA封闭Sf9细胞30 min；

5、用3%的BSA的稀释抗体，最终体积100-200 μl，抗体稀释比例以抗体的灵敏度决定，一般稀释比为1:100-500之间。弃尽小皿和圆孔中的封闭液，加入抗体免疫标记1-2 h；

注意: 抗体的稀释浓度，需要根据抗体的灵敏度来决定。当不清楚抗体的灵敏度时，可以1:200进行尝试，后期再优化抗体的浓度。在进行免疫双标的过程中，若两个蛋白的表达量不一致，尤其是其中一个表达量较低难检测时候，需要选择灵敏的一抗和二抗。

6、用PBS洗涤细胞两次，每次10 min。

7、弃尽圆孔中PBS后，按照1:200-500的比例，用3%的BSA稀释偶联了荧光素的二抗，终体积200 μl，避光孵育Sf9细胞60 min；

注意: 二抗的稀释比例，依然根据其灵敏度来决定。当不清楚抗体的灵敏度时，可以1:300进行尝试，后期再优化抗体的浓度。

8、用PBS洗涤细胞两次，每次10 min；

9、用激光共聚焦显微镜Leica TCS SP5进行观察、拍照。

end